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2017年檢驗(yàn)專業(yè)考試臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)精選
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中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的檢測(cè)
小吞噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)可以分成隨機(jī)運(yùn)動(dòng)和定向運(yùn)動(dòng)，前者類似于布朗運(yùn)動(dòng)。檢測(cè)方法是將采集的白細(xì)胞懸液滴于玻片上，用光學(xué)顯微鏡直接觀察其運(yùn)動(dòng)。也可用毛細(xì)血管法將細(xì)胞懸液裝入硅化毛細(xì)血管中，稍加離心，使細(xì)胞沉積在一端，切去無(wú)細(xì)胞的毛細(xì)血管段，繼而移放在含細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)小瓶中，37℃溫育18～20h，游動(dòng)的細(xì)胞將從毛細(xì)血管內(nèi)外移，在管口形成一細(xì)胞團(tuán)，根據(jù)細(xì)胞面積可判斷受檢中性粒細(xì)胞活動(dòng)的強(qiáng)弱。某些患者中性粒細(xì)胞的任意運(yùn)動(dòng)明顯減弱，甚至消失。中性粒細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)為趨化運(yùn)動(dòng)，測(cè)定方法有多種，其原理相同，而方法大同小異，常用以下兩法：
1.Boyden小室法又稱濾膜小室法，采用特殊的小盒裝置，盒中以一片3～5μm孔徑的微孔濾膜將盒分為上下兩小室。上室加受檢的白細(xì)胞懸液;下室加細(xì)菌菌體或其產(chǎn)物、酵母菌活化的血清等趨化因子。置37℃溫育數(shù)小時(shí)。上室中的中性粒細(xì)胞因受下室內(nèi)趨化因子的招引，使細(xì)胞由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，最后取濾膜，經(jīng)固定、干燥、著染、脫色等步驟，將透明后的濾膜置油鏡下檢測(cè)細(xì)胞在膜內(nèi)通過(guò)的距離，求其趨化單位。
2.瓊脂糖凝膠平板法將含小牛血清的1%瓊脂糖傾到在玻片或平皿中制成凝膠平板，繼而打孔，每三孔為一組，中央孔加細(xì)胞懸液，兩側(cè)孔分別加趨化因子或?qū)φ张囵B(yǎng)液，經(jīng)37℃溫育2～3h后，用2%戊二醛固定，移去瓊脂糖層，經(jīng)染色后，測(cè)量細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離，按下式計(jì)算移動(dòng)指數(shù)。
中性粒細(xì)胞殺菌功能的檢測(cè)
檢測(cè)原則是將受檢細(xì)胞懸液按一定比例混和，繼加活的白色念珠菌懸液，保溫生，加美藍(lán)溶液作活體染色，取樣涂片鏡檢。如胞內(nèi)白色念珠菌呈藍(lán)色，表示該菌已被殺死，共計(jì)100200個(gè)細(xì)胞，分別求其吞噬率和殺菌率。
溶細(xì)胞法更能直接反映細(xì)胞殺菌的情況，將受檢的細(xì)胞懸液與一定量已經(jīng)新鮮人血清調(diào)理過(guò)的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌懸液混合后，置37℃，每隔一定時(shí)間取定量培養(yǎng)物，稀釋后接種固體平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h后，計(jì)算菌落數(shù)，據(jù)以計(jì)算中性粒細(xì)胞的殺菌能力。
正常情況下，對(duì)大腸桿菌的殺菌率約為90%，對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率約為85%.
在臨床常用的硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原試驗(yàn)，本法用以檢測(cè)中性粒細(xì)胞的胞內(nèi)殺菌能力，由于中性粒細(xì)胞在殺菌過(guò)程中能量消耗劇增，耗氧量亦隨之相應(yīng)增加，磷酸己糖旁路代謝活力增強(qiáng)，葡萄糖6-磷酸氧化脫氫，此時(shí)加入NBT可接受所脫的氫，使原先呈淡黃包的NBT還原成點(diǎn)狀或塊狀甲朊顆粒并沉積在胞漿內(nèi)。
近此年來(lái)還采用了新穎的化學(xué)發(fā)光法，中性粒細(xì)胞在吞噬經(jīng)調(diào)理的金黃色葡萄球菌過(guò)程中，伴有化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生，故可用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定中性粒細(xì)胞的吞噬功能及其代謝活性。實(shí)驗(yàn)證明全血化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)可同時(shí)獲得兩種信息，即中性粒細(xì)胞的吞噬功能、代謝活性及受檢血清的調(diào)理功能。由于中性粒細(xì)胞的氧代謝活性與對(duì)細(xì)胞的吞噬率密切相關(guān)，殺菌能力與發(fā)光強(qiáng)度相平行，因此化學(xué)發(fā)光法可檢測(cè)細(xì)胞殺菌功能。因此吞噬細(xì)胞化學(xué)發(fā)光測(cè)定法可用以研究中性粒細(xì)胞的吞噬功能，代謝活性和血清調(diào)理功能，它可在生理溫度和中性環(huán)境下測(cè)定，能較好地反映生理?xiàng)l件下吞噬細(xì)胞的功能，具有準(zhǔn)確靈敏、樣品用量少，簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。其敏感性高于NBT還原試驗(yàn)。
巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)
正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒，據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。
(二)吞噬功能的檢測(cè)
巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能，實(shí)驗(yàn)室常用比細(xì)菌大的細(xì)胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細(xì)胞。其檢測(cè)原理是將受檢細(xì)胞與適量的顆粒抗原混合后，置37℃保溫0.5～1h，其間時(shí)加振搖，最后離心取測(cè)定細(xì)胞制成涂片，染色鏡檢，分別計(jì)數(shù)出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的條件建立正常參考值。
(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測(cè)定
巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶、溶菌酶等，測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的實(shí)用指標(biāo)之一。
1.酸磷酸酶的測(cè)定
(1)硝酸鉛法：本法優(yōu)點(diǎn)是用普通試劑，價(jià)格便宜，一般實(shí)驗(yàn)室均有條件做，封片后可較長(zhǎng)時(shí)間保存，并可用電子顯微鏡研究觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是細(xì)胞必需固定，而且固定條件要求嚴(yán)格，如處理不當(dāng)酶活性易消失，反應(yīng)步驟也較多。
該法基本原理是在適當(dāng)?shù)拿感詶l件下，巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸鈉水解成磷酸鹽后，后者與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛，而磷酸鉛再與硫酸銨反應(yīng)則形成黑色硫化鉛，沉積在胞漿內(nèi)酸所在處，顯示棕黑色顆粒。酶活性強(qiáng)弱可根據(jù)顆粒的數(shù)量和粗細(xì)不同而分級(jí)判斷，顆粒數(shù)量少則細(xì)的為+，顆粒多而粗的為++，顆粒很多且很粗的為+++。
(2)偶氮法：本法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)液中的底物α-萘磷酸鈉被酸性磷酸酶分解后，形成萘酚和磷酸鹽，而萘酚結(jié)構(gòu)中的羥基(-OH)鄰近的活潑碳原子，立即與偶氮染料起反應(yīng)，而產(chǎn)生鮮艷的棕色沉積在酶所在處，缺點(diǎn)是封片后保存時(shí)間短。
2.非特異性酶的測(cè)定該酶比較穩(wěn)定，酶活性喪失較慢，細(xì)胞經(jīng)涂片干燥，置室溫至少可保存半天至一天，因此特別有利于臨床檢驗(yàn)室采用。
常用α-萘醋酸法，該酶可將-萘醋酸分解成萘酚和醋酸，萘酚迅速與偶染料結(jié)合，形成有色反應(yīng)物而沉積。
(四)巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定
激活巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaC12混合液，加入經(jīng)粘附單層巨噬細(xì)胞的試管中，移置37℃，即時(shí)記錄血漿凝固時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)巨噬細(xì)胞與LPS、腫瘤相關(guān)抗原或HbsAg等溫育后，可見血漿凝固時(shí)間明顯縮短。本法穩(wěn)定方便，也是檢測(cè)不同疾病患者巨噬細(xì)胞功能的指標(biāo)之一。
(五)巨噬細(xì)胞表面受體的檢測(cè)
成熟的巨噬細(xì)胞表面具有Fc受體和C3b受體，這些受體能識(shí)別經(jīng)IgG和C3b調(diào)理的顆粒，并迅速與之結(jié)合，促使細(xì)胞對(duì)相應(yīng)顆粒的吞噬，為此檢測(cè)這些受體可間接判斷巨噬細(xì)胞的功能。常用抗羊紅細(xì)胞致敏的羊紅細(xì)胞懸液作指示物進(jìn)行EA花環(huán)試驗(yàn)，也可用抗原(E)抗體(A)補(bǔ)體(C)復(fù)合物作EAC花環(huán)試驗(yàn)。由于操作繁鎖，現(xiàn)僅供研究用。
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